测序技术：从一代到三代，你手上那条序列从何而来
第2章 第1讲 · 从一代到三代
第1集 · 从生物样本到 library：样本制备与测序词汇
测序的起点是生物样本，终点是数字化的 reads；中间每一步都可能改变最终数据。
Sequence 是一条加工链的终点
1 · Sample preparation
细胞裂解，分离 DNA 或 RNA。传统 RNA 流程通常先做 reverse transcription 得到 cDNA。
2 · Library preparation
按问题选择目标区域，或把 DNA 打断成 fragments，再接上平台需要的 adapters，形成 library。
3 · Sequencing
仪器读取许多 template，输出 reads；之后才是 mapping、assembly 和 inference。
样本制备位于所有信号的上游：这里的降解、污染或 amplification bias 会被后续步骤继承。
书中的常规 RNA 路线先做 reverse transcription；Oxford Nanopore 也存在 direct RNA sequencing。
六个词分别指物理对象或数字输出
template
模板：将被测序的一条 DNA/cDNA molecule 或 fragment。
primer
引物：与 template 互补并提供 polymerase 起点的短核酸。
adapter
接头：接到 insert 两端、让 molecule 能被平台捕获和读取的已知序列。
library
文库：许多不同 library molecules 的物理混合物，不是数据库。
read
读段：仪器对一个 molecule 或 clonal group 给出的数字序列输出。
sequencing run
仪器完成的一轮测量；一轮通常产生许多 reads，而不是一条。
template 是物理 molecule；read 是测量后保存的数字实现值。二者不是同一类对象。
后面每个平台都要回答三个问题
Separation（分离）
怎样让不同 templates 的信号不混在一起？
colony · droplet · bead · cluster · single molecule
Amplification（扩增）
是否需要复制 molecule，让信号强到可检测？
target amplification ≠ clonal signal amplification
Detection（检测）
真正被测量的物理量是什么？
fluorescence · light · pH · ionic current
平台名称很多，但可以用同一套 separation–amplification–detection 框架比较。
第2集 · PCR：三温度循环与 2ⁿ 扩增
PCR 增加 template 的物理拷贝数；它本身不读取 nucleotide sequence。
PCR 需要一条 template 和三类工具
template DNA
要复制的序列。
一对 primers
分别限定复制区域的两端，并提供延伸起点。
dNTPs
合成新 DNA strand 的原料。
thermostable DNA polymerase
经受反复高温后仍能延伸新链的酶。
PCR 解决的是数量，不解决“是哪一条序列”：拷贝变多了，但 sequence 仍要靠后面的 detection 来读。
一个 cycle 依次经历三个温度阶段
Figure 2.1，printed p.30
Denaturation 分开双链，primer annealing 确定起点，extension 合成互补链；下一轮会复制上一轮刚产生的 molecules。
理想拷贝数按 2ⁿ 增长，真实效率留下 bias
理想模型
每个 cycle：所有双链 molecules 都加倍。
1 → 2 → 4 → 8 → 16 → … → 2ⁿ
真实反应
效率低于 100%，后期进入平台期；不同 GC、长度和 primer 结合能力的 templates 也可能扩增效率不同。
PCR 很快增加总 DNA，但也会改变初始 molecule 的相对数量，并可能把早期错误一并复制。
第3集 · 第一代 Sanger sequencing：chain termination 与 gel 读序
Sanger 用不同长度的 terminated fragments，把 sequence 转成可排序的 ladder。
Sanger 把三件事串成一条手工流程
Separation
Recombinant DNA 进入细菌；一个 colony 代表一个 founder template 的 clonal population。
Amplification
挑取 colony、提取 DNA，再用 PCR 提高可检测的 molecule 数量。
Detection
少量 chain-terminating ddNTP 产生不同长度 fragments，再按长度排序。
Sanger 的 error rate 很低，仍常用于验证；代价是 separation 和逐反应处理难以大规模并行。
长度编码位置，末端标记编码是哪一个 base
Figure 2.2，printed p.33
ddNTP 缺少 3′-OH，一旦掺入就终止延伸；许多相同 template 在不同位置终止，才得到每种长度都有的 fragment ladder。
左半边四泳道 gel 由下（短）向上（长）读出的是新合成链；右半边单管四色 fluorescent ddNTP 用 capillary 与颜色做同一件事。若问题问的是原 template，还要写 reverse complement。
第4集 · 第二代架构：emulsion PCR 与 454 / Ion Torrent 的「灌注—检测」
第二代把 separation 从细菌里的 cloning 换成体外的 droplets，再由 454 与 Ion Torrent 按 nucleotide 类型轮流灌注、读取信号。
Barcodes 让许多 samples 共用一个 run
大规模并行
大量在空间上彼此分开的 templates 同时被读取；通量不再受逐个 colony 操作的限制。
多样本 barcoding
在混合前给每个 sample 接上独特 barcode；测完后按 barcode 把 reads 分回来源。
并行回答“同一时刻读多少 templates”；barcoding 回答“这些 reads 原来属于哪个 sample”。
Emulsion PCR 在 droplets 中同时完成分离与扩增
装入
油包水 droplets 中加入 bead、primer、template、dNTP 和 polymerase。
复制
理想情况是一滴一个 founder template；PCR 后 bead 表面覆满 clonal 拷贝。
失败模式
一滴若进入两个不同 templates，bead 上会混合两种拷贝，产生 mixed-signal 。
454、Ion Torrent 和 SOLiD 都使用这套分离与扩增机制；Illumina 改用 flow-cell bridge amplification。
灌注—掺入—检测—冲洗：454 读光，Ion Torrent 读电信号
Figure 2.5，printed p.39
454
Nucleotide incorporation 经 pyrophosphate 相关的化学反应产生光。
Ion Torrent
Nucleotide incorporation 释放 H+；semiconductor sensor 读取与 pH 相关的电信号。
一轮只灌一种 dNTP：互补才掺入，记录信号后冲掉、再换下一种。读出的是哪一种 base，由“当前灌的是哪一种”决定；同一次灌注掺入了几颗，则要靠信号幅度推断。
四个 NGS 平台今天的状态：454 已于 2016 年停产，SOLiD 已停产，Ion Torrent 仍在售，Illumina 是最广泛使用的 NGS 技术。
Homopolymer 把“数几个”变成“估幅度”
同一次灌注
Template 出现连续 TTTTTTT 时，一次 dATP 灌注会连续加入多个 A，只形成一个较高的信号脉冲。
为什么会错
7-mer 与 8-mer 对应相邻的理想信号档位；测量噪声会让两档重叠。
只有 flood-and-detect 这一类架构会这样。 Illumina 每 cycle 只加一个 base，不靠信号幅度数 homopolymer 的长度，机制留到 Illumina 那一集。
第5集 · SOLiD：sequencing by ligation 与 two-base colour code
SOLiD 不用 polymerase sequencing-by-synthesis，而用 ligase 和 two-base colour code 读取 template。
一个 probe 的颜色由前两个 bases 共同决定
X 与 Y
与 template 配对；两者的组合决定 fluorophore 的颜色，因此一次读数报告一个 dinucleotide。
N N N
简并位点，不参与这次颜色的判定。
Z Z Z
通用尾部；读光后切除，为下一次 ligation 留出接口。
记住 XYNNNZZZ 的信息结构即可，不需要背完整 4×4 colour code。
五个 primer 起点，让每个 base 被读到两次
一个 cycle
连接匹配的 octamer → 读颜色 → 切除 ZZZ → 连接下一个 probe。
每次向前推进 5 nt，但只报告其中 2 nt。
五个起点
完成一轮后移除延伸链，将 primer 起点前移 1 nt；五个起点合起来覆盖所有位点。
Primer shifts 让一个 base 在相邻的两次 dinucleotide 读数中被读到两次，提供一次内部的 error 检查。
SOLiD 已停产，留下来的是 two-base encoding 的冗余
优势
Two-base encoding 使 substitution error 往往破坏不止一次颜色转换，便于识别不一致。
边界
流程与解码较复杂，AT 含量高的 repetitive regions 的 coverage 也可能较低。Thermo Fisher 已停产该平台，今天不会用它产数据。
本集要带走三件事：sequencing by ligation、two-base colour code、primer shifts。完整 4×4 colour code 的手工解码不在本课程范围。
第6集 · Illumina：bridge amplification 与 reversible terminator
Illumina 把 templates 铺在 flow cell 表面，原位扩增成 clusters，再逐 cycle 读取 fluorescence。
Bridge amplification 让一条附着链就地长成 cluster
① 一条附着链 ② 弓向邻近 primer ③ 从邻近 primer 3′ 端延伸 ④ 反复 → cluster 变性后两条链都保持表面附着；重复弯曲与延伸，局部拷贝逐渐增加
被洗走的是游离试剂与未保留的 strands；表面共价连接的 strands 留下，并在后续 cycles 继续充当 templates。
同样叫 amplification：ARTIC 选目标，cluster 放大信号
ARTIC tiled multiplex PCR
上机前 ：多对 locus-specific primers 将 viral cDNA 做成重叠 amplicons。
任务 = target amplification ；主要 bias 来自 primer 的扩增效率、primer 之间的竞争，以及 binding site 上的 mutation。
Illumina bridge amplification
flow cell 上 ：带共同 adapters 的 library molecule 就地形成 clonal cluster。
任务 = signal amplification；fragment 长度、GC、附着效率和 cluster formation efficiency 仍会改变各 molecule 的相对丰度。
Clonal 只表示一个 cluster 共享一个 founder，不表示每条 library molecule 形成 cluster 的概率相同。Coverage 会继承 RT → ARTIC PCR → library prep → cluster generation → sequencing/mapping 的 bias。
本讲补充 · Quick et al. 2017 · ARTIC protocol v4 · Aird et al. 2011
Reversible terminator 把一个 cycle 限定为一个 base
加入并成像
四种可区分、带 reversible terminator 的 dNTP 同时存在；每个 cluster 只加入当前互补的一颗并暂停。
切除并重复
记录 fluorescence 后，移除 fluorophore 与 terminator，恢复 3′ 端，再进入下一 cycle。
Illumina 用 clusters 取得高并行 short reads；常见设计是 paired-end，例如 2 × 150 bp。它适合 viral consensus、variant calling 和计数类问题，不要求一条 read 覆盖整个 genome。
本讲补充 · 依据 Illumina 官方 SBS chemistry 与 read-length 技术文档
第7集 · 第三代 single-molecule 测序，与三代之间的取舍
Single-molecule 平台取消的是 clonal signal amplification，不是所有可能的 target enrichment。
Clonal detection 与 single-molecule detection 读的对象不同
Illumina / 早期 NGS
一个 bead 或 cluster 中许多 clonal 拷贝同步反应，检测器读取合并后的信号。
PacBio / Nanopore
检测器直接跟踪单个 molecule 的 fluorescence 或 ionic current 轨迹，不需要 clonal signal amplification。
“不需要 amplification”只指 signal detection。 具体 PacBio 或 Nanopore library protocol 仍可能使用 target PCR、amplicon sequencing 或 enrichment。
PacBio 在 ZMW 中边合成边测 fluorescence
Figure 2.7，printed p.42
PacBio 的 long read 来自 polymerase 对一条 template 的持续合成；早期 single-pass SMRT reads 的总 error 可达约 10–15%，不能代表现代 HiFi read。
CCS 把同一 insert 的多次观察合成 HiFi read
环状 template
给双链 insert 两端连接 hairpin adapters，形成 SMRTbell circular template。
多次绕圈
Polymerase 多次绕过同一 insert，得到多个 subreads；每一圈可能在不同位置出错。
Circular consensus
CCS 把 subreads 对齐并取 consensus，生成现代 PacBio HiFi read。
当前 HiFi 的典型 read 长度约 15–20 kb，官方资料报告准确率中位数高于 99.9%。insert 越长，polymerase 在同样时间里绕的圈数越少，能取 consensus 的观察次数也越少——read 长度和准确率是同一笔账的两端。
本讲补充 · 依据 PacBio 官方 SMRT sequencing 与 HiFi 技术文档
Nanopore 把一段 local sequence context 映射成 ionic current
Figure 2.8，printed p.43 · basecalling 依赖 local sequence context 是本讲补充
Ionic current 不是由一个孤立 nucleotide 单独决定：pore reader 中同时有多个 bases，一段 local sequence context（常简称 k-mer）共同塑造 squiggle，再由 neural-network basecalling 解码。
Nanopore 可读取 native DNA 或 RNA、同步识别部分 modifications，并从 short read 延伸到 ultra-long read；长度主要受送入 pore 的 molecule 完整度限制。
Table 2.1 记录的是原书成书时的代际平均水平
Speed, bp/hour
105
3 × 1010
3 × 108
Typical read length
1,000
2 × 150
30,000*
Reads in parallel
96
106
105
Amplification step
yes
yes
no
Error rate
low
medium
medium-high
* 平均 fragment 长度仍在 30,000 bp 左右，但 Oxford Nanopore 已报告超过 200 万 bp 的单条 read（Amarasinghe et al. 2020）。
Table 2.1，printed p.31 · 数值是原书对每一代的 averages，不是今天每台 instrument 的 specification
第三代那一列把 PacBio HiFi 和 Oxford Nanopore 平均成了一个数。两者的 read 长度分布和错误率差很多，下一页分开看。
授权与来源 · Attribution
Adapted and translated into Chinese from: Stadler T, Magnus C, Vaughan T, Barido-Sottani J, Bošková V, Huisman JS, Pečerska J. Decoding Genomes: From Sequences to Phylodynamics (1st ed., 2024). https://decodinggenomes.org · DOI: 10.3929/ethz-b-000664449. Original licensed under CC BY-SA 4.0; this derivative work is likewise released under CC BY-SA 4.0. Changes: translated to Chinese, reorganised into video lessons and slides; Figures 2.1, 2.2, 2.5, 2.6, 2.7 and 2.8 reproduced as cropped teaching figures; Table 2.1 re-typeset and translated; course-specific comparisons and teaching diagrams added.
Source range: Chapter 2 §§2.1-2.4, printed pp. 27-44 · Reused book-owned figures: 2.1, 2.2, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8 (CC BY-SA 4.0)
